在使用高效液相色譜儀的過程中,我們最常遇見的問題就是“堵”?!岸隆钡谋憩F(xiàn)現(xiàn)象就是壓力升高,直接原因就是流路不暢。下面我們一起來探究一下HPLC常見堵塞原因有哪些,了解故障發(fā)生的原因,既可以在碰到堵塞故障時(shí)不至于束手無策,又可以防微杜漸,防患于未然。(下面以Agilent LC 1260 Infinity II為例進(jìn)行討論)
“堵”的原因一般有:
沒有過濾好流動(dòng)相。
樣品中有微粒。
細(xì)菌污染。
泵或進(jìn)樣器墊圈產(chǎn)生碎片。
預(yù)柱、保護(hù)柱和分析柱中漏出填料。
毛刺和銼屑進(jìn)入。
流動(dòng)相中的結(jié)晶鹽。
系統(tǒng)中進(jìn)入了其它顆粒性物質(zhì)。
操作不當(dāng)導(dǎo)致。
排查哪個(gè)位置“堵”的方法
絕大多數(shù)情況下,整個(gè)系統(tǒng)只有一個(gè)地方發(fā)生堵塞。查堵的方法是從尾向前逆行分段拆開,仔細(xì)觀察壓力數(shù)值,如果某一個(gè)部件(柱子除外)裝上和拆下時(shí)的壓力差別很大,可進(jìn)行變化判斷。至于柱子的堵塞,可以通過更換同樣規(guī)格的柱子,壓力是否一致來判斷。
解決液相色譜儀堵塞的方法(包括但不限于以下)
(1)??? 溶劑濾頭:玻璃材質(zhì)的濾頭用30%~35%稀硝酸浸泡2-3小時(shí)(視污染程度延長(zhǎng)浸泡時(shí)間),不可超聲,然后用大量超純水徹底沖洗過濾頭;金屬材質(zhì)的濾頭可以超聲處理,不可用硝酸浸泡,清潔之后用超純水漂洗干凈。必要時(shí)更換新的。
(2)??? 溶劑管:如果是因?yàn)榫彌_鹽停滯時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致長(zhǎng)菌,管路堵塞??梢圆鹣聛碛眠m量濃度的硝酸進(jìn)行浸泡和不斷用水進(jìn)行沖洗,必要時(shí)也可進(jìn)行超聲處理。(根據(jù)污染程度延長(zhǎng)浸泡和清洗時(shí)間或增大硝酸的濃度)
(3)??? 過濾白頭:可將過濾白頭取出,用10%異丙醇超聲半個(gè)小時(shí),再用超純水沖洗干凈。必要時(shí)更換新的。
(4)??? 單向閥芯:此處堵了會(huì)導(dǎo)致泵壓力不穩(wěn),有氣泡,嚴(yán)重時(shí)泵不過液,清洗不能排除故障時(shí),更換新的配件。
(5)??? 自動(dòng)進(jìn)樣器針座:此處堵了會(huì)造成進(jìn)樣口漏液,反沖不能解決故障時(shí),更換針座。
(6)??? 色譜柱:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞,則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)洗脫能力的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上,用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí),如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。必要時(shí)更換新柱子。
(7)??? 流通池:分析污染的物質(zhì)是什么,對(duì)癥下藥。例如:如果只是緩沖鹽結(jié)晶導(dǎo)致堵塞,可以使用熱水沖洗系統(tǒng)。用上述方式無法解決時(shí),可以嘗試使用熱水不斷變換管路連接方式(正沖、反沖)沖洗系統(tǒng)。另外,還有一種方式非必要一般不建議使用:在不連接色譜柱的情況下,先用超純水沖洗20min,然后用5%硝酸沖洗2個(gè)小時(shí),最后再用超純水沖洗至流出液體為中性即可。以上程序均建議在流通池設(shè)置壓力限制(比最大耐受壓力低5~10bar)條件下使用。如上述方法不果,就需要更換新的配件。
預(yù)防液相色譜儀堵塞的方法(包括但不限于以下)
溶劑:
色譜使用的溶劑必須是色譜純,并且使用前需要抽濾。使用時(shí)務(wù)必蓋好瓶蓋。
水相需要使用二級(jí)以上的蒸餾水/18.2MΩ,并且每天都需要更換。
使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí),注意避光,使用棕色瓶存放,避免乙腈聚合。
僅使用干凈的高硼硅酸鹽玻璃瓶。
配置夠1-2天使用的流動(dòng)相即可。
樣品:
保證樣品充分溶解,樣品瓶干凈沒有顆粒物。
樣品建議使用0.2μm濾膜過濾,或者高速離心取上清液進(jìn)樣。
泵準(zhǔn)備:
Purge:除去通道中舊溶劑、鹽沉積或顆粒物(每個(gè)通道4ml/min,3分鐘)。
更換流動(dòng)相時(shí),注意泵腔和色譜柱里鹽溶液和有機(jī)相是否互溶,使用高比例水相(比如?80%水相)過渡鹽相和有機(jī)相。
柱塞桿清洗:10%異丙醇,不回收使用,每次開機(jī)確保柱塞桿清洗液充足。
打開排氣閥5ml/min純水壓力正常情況下四元泵10bar以內(nèi)(二元泵20bar以內(nèi))。如果壓力高,則需要拆下過濾白頭??搭伾欠癜l(fā)黑發(fā)黃。過濾白頭上有黑碎屑,則需考慮換泵密封墊。過濾白頭上粘糊糊,則需考慮體系是否長(zhǎng)菌,可將過濾白頭進(jìn)行超聲清洗或者更換。
使用四元泵時(shí),緩沖鹽流動(dòng)相/水相置于A/D通道中,有機(jī)相置于B/C通道中。
進(jìn)樣器:
根據(jù)分析化合物極性大小,選擇最適合的洗針溶液。
更換洗針溶液后,右擊進(jìn)樣器?prime?洗針管路?60s,分析方法設(shè)置洗針程序。
柱溫箱:
選用恰當(dāng)?shù)慕宇^連接不同廠家色譜柱,或使用箍錐前端可以伸縮的萬能接頭來適配不同廠家色譜柱,柱后采用紅色?Peek?管線接入檢測(cè)器入口。
流動(dòng)相有鹽溶液時(shí),首先用高比例水相過渡色譜柱,然后讓鹽溶液進(jìn)入色譜柱,避免鹽析堵塞。
檢測(cè)器準(zhǔn)備:
檢測(cè)器流通池同樣注意避免鹽溶液和有機(jī)相直接相撞。
關(guān)機(jī):
高比例水相(比如90%水相)沖洗所有通道約30min,去除緩沖鹽溶液和顆粒物。
高比例有機(jī)相(比如?90%甲醇)沖洗所有通道。
進(jìn)樣器在沖洗過程中?Mainpass?和?Bypass?兩路反復(fù)切換?5~10?次,沖洗六通閥的流路和溝槽。
針座位置如有白色鹽析,用純水洗瓶沖洗干凈后拭干。
采用適當(dāng)?shù)谋4嫒軇ū热缂状迹┍4嫦到y(tǒng)。
參考資料:
《Agilent University LC OpenLab CDS 2標(biāo)準(zhǔn)操作培訓(xùn)》
《Agilent 1260/1390 Infinity LC 快速參考指南》
《Agilent LC溶劑使用注意事項(xiàng)》